灰树花胞外多糖发酵液的抗病毒作用研究(2)

　　（3）摇瓶发酵培养。采用500 mL挡板三角瓶，装液量100 mL，121 ℃高压常规灭菌20 min后，用破口的10 mL移液器吸取10%种子液（即从100 mL种子液中吸取含有10块菌丝体的种子液）移入以上挡板三角瓶，25 ℃，160 r·min-1培养10 d。

　　（4）发酵液处理。发酵结束后，将发酵液3 000 r·min-1离心20 min，上清过0.22 μm滤膜除菌后于4 ℃冰箱保存即可。

　　（5）苯酚硫酸法测定多糖含量[8]。

　　1.2.2 1%鸡红血球配制用5 mL注射器吸取1 mL柠檬酸钠液，采集2～6月公鸡的红细胞，1 500 r，离心5 min，吸弃上清液。用生理盐水洗涤3次，1 500 r，前两次离心5 min，最后1次10 min。吸弃上清液，将沉积的红细胞配成1%红细胞悬液。（4±2） ℃储存，备用。

　　1.2.3 病毒的增殖将新城疫病毒液50倍稀释后，接种于10日龄健康鸡胚，每枚鸡胚0.l mL，弃去24 h内死亡的鸡胚，收集48～72 h内死亡鸡胚尿囊液，加双抗后分装保存于-80 ℃冰箱备用。

　　1.2.4 病毒的滴定在鸡胚水平测定病毒半数致死量（ELD50），将病毒液用0.9%生理盐水作连续10倍的倍比稀释，从10-3～10-9为止，每个稀释度经尿囊腔接种各5枚鸡胚，每枚0.l mL，每隔10 h照蛋。弃去24 h内死亡鸡胚，连续观察至120 h，记录各胚死亡时间，按照Reed和Muench的方法计算病毒的半数致死量（ELD50）[9]。攻毒鸡胚的试验用病毒量为5×ELD50。

　　1.2.5 灰树花发酵胞外多糖对鸡胚的毒性试验将3种浓度267，53.4，10.7 μg·mL-1的灰树花发酵胞外多糖发酵液接种到9～11日龄的鸡胚尿囊腔中，每种浓度接种20枚种蛋，接种量为0.l mL·枚-1，设对照组20枚，接种等量的无菌生理盐水。接种灰树花发酵胞外多糖发酵液后每隔12 h照蛋，记录死亡时间，连续观察直到144 h结束，最后根据存活鸡胚数计算灰树花发酵胞外多糖发酵液对鸡胚的毒性，确定无毒性最大浓度，该浓度即为对鸡胚的最大安全浓度。

　　1.2.6 灰树花胞外多糖发酵液抑制新城疫病毒致鸡胚致病试验将24只试验鸡胚随机分为4组：1组为阴性对照组，接种病毒与生理盐水对照， 0.2 mL·枚-1， 2组为灰树花发酵胞外多糖原液（多糖含量为0.267 mg·mL-1），3组为灰树花发酵胞外多糖原液作10倍稀释，4组为生理盐水对照组（0.2 mg·mL-1）。将“灰树花发酵多糖”做10倍量稀释，并将不同稀释度药液分别与5×ELD50病毒液等体积混合均匀，37 ℃作用1 h后，分别经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各6枚，每胚接种0.2 mL，然后37 ℃继续孵化鸡胚，每24 h照蛋1次，并记录死亡情况，测定鸡胚尿囊液的血凝效价，直至l44 h试验结束。

　　2 结果与分析

　　2.1 NDV对鸡胚的半数致死量（ELD50）和血凝效价

　　由表1可知，新城疫毒株接种后2 d内鸡胚死亡。然后，在无菌条件下吸取尿囊液，用制备好的1%红细胞悬液进行凝集试验。经检测：病毒的血凝价为27～28，距离比例=（高于50%的百分数-50）/（高于50%的百分数-低于50%的百分数）=100-50/100-40=0.83。

　　Log ELD50=高于50%的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数（-1）=-8+0.83×（-1）=-8.83。即ELD50=8.83。

　　2.2 灰树花胞外多糖发酵液毒性试验结果

　　由表2可知，接种灰树花胞外多糖发酵液浓度为267，53.4，10.7 μg·mL-1的条件下，培养144 h后，鸡胚均发育良好，血管分布清晰、明显，证明该灰树花多糖发酵液对鸡胚实际无毒。

　　2.3 灰树花胞外多糖发酵液在鸡胚中的抑制新城疫病毒试验结果

　　鸡胚在接种新城疫病毒（阳性对照组）后48 h内死亡，死亡鸡胚全身出现严重出血、水肿，经照蛋器观察呈透明状态，解剖观察肝脏有坏死和出血点，出现溶血现象。接种试验结果如表3。

　　从表3中可以得出，接种灰树花胞外多糖发酵液组与阴性对照组相比，死胚率明显降低，尿囊液血凝效价也明显降低，说明灰树花胞外多糖发酵液能有效抑制增殖或杀灭新城疫病毒，从而能够明显降低鸡胚死亡率。

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