荷斯坦奶牛粪便中双歧杆菌的分离鉴定与耐药性分析

　　摘要：运用TPY培养基，从健康的荷斯坦奶牛的粪便中分离、培养、筛选出1个肠道菌株，对其进行了细菌培养、菌落形态观察、染色镜检、分离纯化、生化试验鉴定及药敏试验研究。结果表明，分离培养出的菌株为长双歧杆菌，双歧杆菌对氟苯尼考极其敏感，对青霉素耐药。该研究为反刍动物微生态制剂的研究工作奠定了基础。

　　关键词：荷斯坦奶牛；粪便；双歧杆菌；分离；鉴定；耐药性

　　中图分类号：S823.9 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.01.010

　　关于反刍动物养殖用微生态制剂的研究国内外都比较关注，但能够用于反刍动物的饲用微生态制剂却较少。国内应用于反刍动物养殖业的微生态制剂比较繁杂，效果不一，而且多数是为人类和畜禽设计，有些微生态制剂并不适合反刍动物的体内环境，也不能被很好地吸收利用，缺少反刍动物专用的微生态制剂。双歧杆菌作为微生态制剂的菌种之一，可直接饲喂动物，它以活菌形式在动物消化道中与病原菌通过竞争性抑制作用来增强动物免疫力，并直接参与胃肠道微生态的平衡，调节胃肠道功能。为改善和提高反刍动物的抗病能力，提高繁殖性能和生产性能，最大程度地提高经济效益，更好地发展反刍动物养殖业，了解荷斯坦奶牛肠道正常菌群的耐药性，本研究从健康的荷斯坦奶牛的新鲜粪便中分离到双歧杆菌，为进一步开展微生态制剂的开发和应用奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 样品来源样品来自于从青岛某牛场采的健康牛的新鲜粪样。放于灭菌平板置于4 ℃备用。

　　1.1.2 试验材料莫匹罗星锂盐改良MRS培养基、TPY琼脂培养基（购自青岛高科园海博生物技术有限公司）；五糖发酵管（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露糖）、七叶灵发酵管、棉籽糖发酵管、山梨醇发酵管、H2S、靛基质、MR试剂、VP试剂、吲哚试剂、药敏纸片（购自上海欧韦达仪器科技有限公司）；空气浴震荡器（HZQ—C哈尔滨市东明医疗仪器厂）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 样本的采集与处理取无菌培养皿3套，倒入普通琼脂培养基，冷却。用移液枪吸取10-1稀释菌悬液200 μL，滴于培养基平板上，用涂布棒将培养基上的菌液分散均匀，平板正放静置5 min，菌液稍干后，于37 ℃恒温培养18 h。

　　1.2.2 细菌的分离、纯化及形态学观察取各种稀释浓度的粪便100 μL涂布于莫匹罗星锂盐改良MRS培养基上，在厌氧条件下，37 ℃培养3 d。挑取莫匹罗星锂盐改良MRS培养基上蓝色菌落接种到TPY培养基上纯培养以获得单菌落，并做好标记[1]。

　　1.2.3 生化试验挑取经革兰染色且呈阳性的末端分叉的杆菌进行纯化后，按照常规方法进行糖发酵试验[2]、H2O2酶试验、KOH试验，并观察结果。

　　1.2.4 药敏试验采用纸片扩散试验法。其操作方法如下：将分离得到的双歧杆菌菌液进行稀释，稀释到1×10-6，吸取100 μL于TPY培养基上。按常规操作贴好纸片置于37 ℃培养 12～48 h 后观察结果。

　　2 结果与分析

　　2.1 菌落形态及染色结果

　　TPY培养基上菌落的生长特性、形态及革兰染色镜检的结果如下：TPY琼脂培养基上的菌落形态为中央凸起，呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，菌落不透明，乳白色，表面轻度突起，单个存在，很少成片，菌落大。G+菌，1 μm×3 μm，单个或成对排列，如图1、图2。

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