复方银杏叶颗粒改善人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤的作用及其机制研究(3)

　　将HUVEC按2×10⁴个/孔铺于12孔板中，按照2.2中方法处理后，收集细胞培养基，3 000 r·min^-1离心20 min，收集上清。采用双抗体夹心法测定样品中ET-1水平。检测方法参照人ET-1 ELISA试剂盒使用说明书。
　　2.6 Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡
　　将HUVEC按2×10⁴个/孔铺于12孔板中，按照2.2中方法处理后，收集细胞培养液到离心管内备用，胰酶消化细胞，收集到同一离心管内，1 000×g离心5 min。吸去上清，加入1 mL 4 ℃预冷的 PBS，重悬细胞，1 000×g离心5 min。用250 μL Binding Buffer重悬细胞，取100 μL细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/FITC 和10 μL的PI （20 mg·L^-1）溶液，混匀后于室温避光孵育15 min后，在反应管中加400 μL PBS，混匀后使用流式细胞仪分析。
　　2.7 Caspase-3活性检测
　　将HUVEC按2×10⁴个/孔铺于12孔板中，按照2.2中方法处理后，采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中Caspase 3酶活性。检测方法参照Caspase 3 活性检测试剂盒产品说明书。
　　2.8 Western blot分析Bcl-2，Bax含量测定
　　将HUVEC按1×10⁵个/孔铺于6孔板中，按照2.2中方法处理后，弃去上清，每孔加入100 μL蛋白裂解液，混合均匀后4 ℃，12 500×g离心20 min。调整总蛋白含量一致后，取上清后加入5×蛋白上样缓冲液，90 ℃加热5 min使充分变性。电泳分离蛋白后，转膜至NC膜，BSA（5 g·L^-1）室温封闭1 h，经TBS-T漂洗后，4 ℃孵育Bcl-2，Bax和β-actin，12 h后使用TBS-T漂洗。加入二抗IgG-HRP室温孵育2 h，TBST漂洗后进行化学发光。
　　2.9 统计学处理
　　本实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。实验结果以±s表示，使用t检验进行两两比较，使用方差分析进行多组数据比较。
　　3 结果
　　3.1 复方银杏叶颗粒对内皮细胞的保护作用
　　不同质量浓度的复方银杏叶颗粒（80，160，320，640 mg·L^-1）与HUVEC细胞分别孵育24，48，72，96 h，各组细胞状态良好，形态无明显变化。分别在24，48，72，96 h后，使用H₂O₂处理8 h。正常对照组细胞存活率为100%，药物干预48 h后，各给药组与模型组相比细胞存活率显著提高，在72，96 h时，细胞活性降低，各给药组与模型组差异减少，显著性降低，见图1。在药物作用48 h时观察细胞状态，正常对照组细胞呈鹅卵石样排列，结构完整，折光性较好。H₂O₂干预后细胞排列混乱，细胞皱缩、变小，坏死细胞、细胞碎片较多。复方银杏叶预处理过的细胞排列、形态明显改善，与模型组差异明显，见图2。以上实验结果表明，复方银杏叶颗粒最佳药物作用时间为48 h，在该作用时间下，质量浓度为640 mg·L^-1的药物药效最好，能够有效保护内皮细胞，抑制H₂O₂引起的氧化应激损伤。
　　3.2 复方银杏叶颗粒对内皮细胞氧化应激损伤相关指标的影响
　　药物预处理48 h，H₂O₂干预8 h后，各给药组与模型组比较，LDH释放量显著减少（P<0.05），MDA含量显著减少（P<0.05），SOD活性显著提高（P<0.05），NO含量显著提高（P<0.05）。H₂O₂干预后，ET-1含量显著升高，给药后，各个药物质量浓度均显著降低ET-1含量，见表1。以上药效具有较明显的剂量依赖性，且质量浓度为640 mg·L^-1的复方银杏叶颗粒的药效优于其他质量浓度。
　　3.3 复方银杏叶颗粒抑制氧化应激诱导的细胞凋亡作用
　　3.3.1 复方银杏叶颗粒对细胞凋亡的保护作用通过Annexin V-FITC/PI双染色法，使用流式细胞术检测细胞凋亡作用。H₂O₂干预8 h后，与正常对照组相比细胞凋亡率显著升高（P<0.05），80，160，320，640 mg·L^-1药物预处理的内皮细胞凋亡率依次为89.34±1.87，88.30±4.27，85.43±4.19，80.38±3.28（80，160，320 mg·L^-1组，P<0.01，640 mg·L^-1组，P<0.05），见图3，表2。

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