穿心莲甲羟戊酸5—焦磷酸脱羧酶基因的克隆与表达(3)

　　用最大似然法（maximum likelihood）构建系统发育树（图5），结果表明，穿心莲与丹参Salvia miltiorrhiza的MVD蛋白聚为一类，并与假马齿苋Bacopa monnieri、芝麻Sesamum indicum的MVD蛋白亲缘关系较近。
　　2.4 基因表达分析 Real time PCR检测基因表达结果表明（图6），在穿心莲叶片中，MVD基因的表达量在花蕾期较低，初花期增加；到了花果混合期和青果期表达量均下降。而茎中的表达量趋势与叶片中不同，花蕾期MVD基因表达量最高，以后的3个时期表达量均较低。总体说来，无论是在茎还是叶片中，MVD基因在各时期表达量的倍数差异不大，均小于0.1。
　　3 讨论
　　由于穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯等活性成分的药理作用重要而广泛，并且穿心莲中新的活性成分、各活性成分新的药理作用不断被发现，人们对于红色字体碱基代表差异碱基；获得的克隆1.1 024位核苷酸由G变为A，氨基酸由T变为A，共有1个单碱基差异，产生1个氨基酸变化；克隆2.635位核苷酸由A变为G，氨基酸由K变为R，926位核苷酸由T变为A，氨基酸由F变为Y，939位核苷酸由A变为G，1 024位核苷酸由G变为A，氨基酸由A变为T，共有4个单碱基差异，产生3个氨基酸变化；克隆3. 1 024位核苷酸由G变为A，氨基酸由A变为T，1 250位核苷酸由T变为A，氨基酸由F变为Y，共有2个单碱基位点差异，产生2个氨基酸变化。
　　穿心莲的分子生物学研究逐渐日益增多。印度学者对穿心莲的遗传基础进行了系统分析，积累了遗传多样性全面评估和转录组深度测序等重要的数据，为后续进行资源保护和开发、基因克隆、功能精确解析和代谢网络调控等工作奠定了坚实的基础。国内已有学者克隆了穿心莲内酯合成途径中的ent-柯巴基焦磷酸合酶基因，并且对它的功能进行了研究^[10-13]。
　　在植物中，MVD蛋白催化MVA途径的第一个步骤，即甲羟戊酸5-焦磷酸的脱羧反应，从而为萜类代谢提供重要原料IPP。在药用真菌灵芝Ganoderma lucidum体内，MVD基因的表达量与三萜类成分的合成量呈正相关^[14]。在革兰氏阳性细菌中，MVD蛋白催化生成的IPP也是肽聚糖（peptidoglycan）和聚类异戊二烯（polyisoprenoid）等物质合成的关键中间代谢物，因而是抗菌研究的理想靶点^[3]。在动物体内，MVD蛋白通过MVA途径催化合成的下游产物以胆固醇及其衍生物为主，因此，它可能成为治疗由胆固醇引发的疾病，如心血管疾病及癌症等疾病的药物靶标^[4]。以上研究表明，MVD蛋白是许多生物体内的重要的蛋白。
　　4 结论
　　本研究根据转录组测序数据，获得了穿心莲甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶基因的3个克隆，它们所包含的ORF均长为1 260 bp，编码419个氨基酸，克隆之间的差异发生在4个碱基处。它的蛋白序列中具有保守的氨基酸残基，决定催化反应特异性和活性；N端不含有质体定位的信号肽序列，这与文献报道穿心莲内酯合成的MVA途径定位在细胞质中相一致。系统发育分析表明，穿心莲与丹参Salvia miltiorrhiza的MVD蛋白聚为一类，并与假马齿苋Bacopa monnieri、芝麻Sesamum indicum的MVD蛋白亲缘关系较近。在穿心莲茎和叶片中，MVD基因的表达量分别在花蕾期和初花期最高，但各时期表达量的倍数差异不大。本研究获得的MVD基因，为后续进行详细的功能解析，并进一步应用于穿心莲内酯成分的遗传调控，奠定了基础。

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