穿心莲甲羟戊酸5—焦磷酸脱羧酶基因的克隆与表达(2)

　　1 材料与方法
　　1.1 提取总RNA 穿心莲种植在江西中医药大学神农园。取植株地上部分，按照已报道的方法提取总RNA^[5]，所用化学试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他分子生物学试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。
　　1.2 克隆MVD基因采用Invitrogen公司的PrimeScriptTM 1 st Strand cDNA Synthesis Kit 合成cDNA第一链。根据银杏Ginkgo boliba L. MVD基因（GenBank登录号AY757921）全长序列^[6]，在穿心莲转录组拼接序列（GenBank登录号 GBJB00000000）中搜索同源序列，获得1条相似度最大的序列（GenBank登录号GBJB01038913）。利用ORF finder软件预测开放阅读框，为1 260 bp。针对ORF设计1对引物， 5′-ATGGCGGCTGAGAAATGGGTG-3′和5′-TCACTTGGGAAACCCGGTTTC-3′，从穿心莲的cDNA中扩增全长。引物由苏州泓迅生物科技有限公司合成。
　　以cDNA第一链为模板，采用TaKaRa公司高保真DNA聚合酶扩增目标序列，反应总体积为50.0 μL，包括1 μL cDNA，0.25 μL Takara Prime STAR HS DNA Polymerase，5 μL 10×buffer，4 μL dNTP MIX（各2.5 mmol·L^-1），ApMVD-F和ApMVD-R引物（10 μmol·L^-1）各1.5 μL，36.75 μL ddH₂O。反应程序为95 ℃预变性1 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸7 min终止反应。
　　扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测割胶回收后，采用Axygen离心柱型PCR产物纯化及胶回收试剂盒回收扩增产物，取2 μL，添加2.5 μL连接缓冲液后，与0.5 μL克隆载体pMD18-T进行连接，总体积5 μL。
　　在4 ℃冰箱连接过夜（8～12 h）后，转化大肠杆菌DH5α，涂布在LB平板上（含有50 mg·L^-1氨苄青霉素），37 ℃倒置培养6～9 h。挑取单克隆到LB液体培养基（含有50 mg·L^-1氨苄青霉素Amp）内，待到液体培养基变浑浊（大约2 h），以培养大肠杆菌的菌液为模板，用目的片段的上、下游引物进行PCR扩增，挑选阳性克隆，用M13 Primers进行DNA测序。由苏州泓迅生物科技有限公司进行测序。
　　1.3 生物信息学分析采用BioEdit软件进行开放阅读框（Open reading frame，ORF）编码氨基酸序列的翻译，NCBI网站上的Conserved Domain Search程序进行保守结构域分析，BlastP程序做同源性搜索。
　　采用ProtParam软件（http：//au.expasy.org/tools/protparam.html）计算蛋白质的相对分子质量和等电点，预测一级结构。采用DNAMAN软件进行蛋白质的多序列比对，MEGA6.06软件构建系统进化树。用ChloroP 1.1 Server软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）鉴定蛋白质的叶绿体定位信号序列。
　　1.4 基因表达分析在花蕾期、初花期、花果混合期、青果期，分别取穿心莲植株的地上部分，分离茎和叶，分别提取总RNA，用于基因表达分析，每个时期取3株。
　　Real-time RT-PCR采用SYBR Green染料法，在Applied Biosystems ViiA7 Real-Time PCR System仪器上进行。荧光定量试剂为Roche FS Universal SYBR Green Master，反应体积10 μL，MVD基因的扩增引物为5′-AGCCTGTTTGGTGGATTCGT-3′和5′-CAGCGGTGCTTCTGTTATGC-3′，预期产物大小为478 bp；根据穿心莲18S核糖体RNA基因序列（GenBank： FJ002343.1）设计内参引物5′-CTGCCTTCCTTGGATGTGGT-3′和5′-TTTCTGCCCTATCAAC TTTCGA-3′，预期产物大小为125 bp。扩增程序是95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 cycles；熔解曲线是95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。
　　每个模板每次扩增3个复孔。实验重复3次，结果分析采用比较CT值法^[7]，在Excel软件上进行。
　　2 结果与分析
　　2.1 总RNA提取利用无液氮法，提取获得了质量较好的穿心莲总RNA。
　　2.2 ORF扩增在1 000，2 000 bp之间有1条明显的条带（图1）。
　　胶回收后，进行TA克隆，测序，获得3条MVD基因的全长开放阅读框，长1 260 bp，编码由419个残基组成的氨基酸序列，序列间具有核苷酸变化和氨基酸差异（图2）。为方便阐述，后续分析均以转录组拼接序列为例进行。
　　2.3 MVD基因生物信息学分析保守结构域分析表明（图3），以上MVD蛋白均包含一个甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（diphosphomevalonate decarboxylase）家族的保守结构域。
　　ProtParam软件分析结果表明，MVD蛋白的肽链由20种氨基酸组成，分子式为C₂₀₃₅H₃₂₂₆N₅₆₈O₆₂₉S₁₄，理论相对分子质量为46.162 2 kDa，等电点pI为6.23，其中Ser（10.5%）和Ala（8.8%）量较高，Met（1.4%），Trp（1.7%），Cys（1.9%）量较低。Ser，Met分别为44个（10.5%）和6个（1.4%）。带负电荷的氨基酸（Asp+Glu）共53个，带正电荷的氨基酸（Arg + Lys）有49个。不稳定指数45.28，表明属于不稳定蛋白质。总平均疏水指数为-0.298。
　　亚细胞定位分析结果表明，MVD蛋白的N端不含有质体定位的信号肽。序列比对结果表明（图4），MVD蛋白中包含11个保守氨基酸；有8个保守氨基酸、1个非保守氨基酸参与到与ATP结合的过程中^[3，8]；307位保守的天冬氨酸是决定催化活性高低的关键氨基酸^[9]。

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