[摘要] 该文选择8种含有地格达类蒙药原料药材的蒙成药为对象，首先对基原植物肋柱花和苦地丁样品采用改良CTAB法提取其总DNA，使用psbA-trnH片段进行扩增、测序，与GenBank下载的8种蒙成药中其他原料药材psbA-trnH序列进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。同时对8种蒙成药进行总DNA的提取，并使用DNA纯化试剂盒进行纯化，通过PCR反应对叶绿体rbcL序列进行扩增，再分别选择肋柱花和苦地丁鉴别引物进行扩增，并将扩增后的产物进行测序。所得序列校正、比对后，进行比对分析。结果表明，地格达-4汤、地格达-8散、地格达-4散中均含有原料药材肋柱花，毕业论文格式苦地丁特异鉴别引物扩增分析可以鉴定出利胆八味散、伊赫哈日-12和阿嘎日-35中含有苦地丁。该研究结果说明，位点特异PCR方法用于鉴定蒙成药中原料药材具有一定的可行性。 

　　[关键词] 分子鉴别；蒙成药；“地格达”；位点特异性PCR 

　　[Abstract] To explore a new method for identification of Mongolian patent medicine （MPM） by PCR amplification of specific alleles. Eight kinds of MPM were used to study the identification of ″Digeda″ raw materials. The total DNA of Lomatogonium rotatum and Corydalis bungeana samples were extracted through modified CTAB method， psbA-trnH sequence was amplified by PCR and sequenced directionally. Specific primer was designed. The DNA of 8 kinds of MPM also was extracted and purified by the commercial DNA purification kits. The rbcL and two pair of specific primers sequences were amplified. The specific amplified products were sequenced in forward directions. All specific sequences were aligned and were analyzed. The results indicated that L. rotatum can be identified by specific primers from Digeda-4 Tang， Digeda-8 San， Digeda-4 San， and C. bungeana medicinal materials can be identified by specific primers from Li Dan Ba Wei San， Yi He Ha Ri-12 and A Ga Ri-35. PCR amplification of specific alleles can stably and accurately distinguish raw medicinal materials in MPM. 

　　[Key words] molecular identification； Mongolian patent medicine； ″Digeda″ medicinal plants； PCR amplification of specific allele 

　　蒙医药学是祖国医药学及民族医药体系的一个重要组成部分，在维护人民群众的健康事业中发挥着重要的、独特的作用。据资料统计，经考证的蒙药材共有1 340余种，来源于植物类的蒙药占到全部蒙药材的70%以上[1]。“地格达”来自印度梵语音译，蒙语为苦的意思。作为蒙医常用药之一，“地格达”类蒙药已经具有一千多年的应用历史，在蒙药处方中常常作为主药之一被使用[2]。这类蒙药具有显著的清热解毒作用，在蒙医临床上主要用于治疗肝胆系统疾病。 

　　根据文献记载和实际调查研究，使用地格达类蒙药材作为原料生产的蒙成药多达20余种，如地格达-4汤、利胆八味散、壮西-21散、伊赫汤、给旺-9散等[3]。而由于内蒙古地区作为“地格达”类蒙药使用的植物多达7科30余种[4-6]。目前，一些地格达类蒙药材产量很难满足市场需求，市场供求矛盾日益尖锐。因此市场上流通的一些蒙成药在原料投放上难免就会有混伪品掺入，这将严重影响其药效和安全性。对于药材的直接鉴定还需要具备丰富药材鉴别经验的人员才能够准确的识别出正品和混伪品，而对于蒙成药中原料药材的准确鉴定更是困难，传统方法的鉴别手段虽然占据主导地位，但仍受特异性不强、稳定性差、样品用量大等特点制约。而理论上，采用DNA分子技术鉴定蒙成药的方法可以不受蒙成药中其他药材的化学成分干扰与影响，直接从基因水平提供鉴定依据，即使是没有任何鉴别经验的人员通过分子技术流程都能够准确区分蒙成药中原料药材的正品及其混伪品。 

　　截至目前，一些学者主要采用显微和理化的方法对蒙成药中地格达类原料药材进行鉴别研究[7-11]。而使用DNA分子方法鉴别蒙成药中地格达类原料药材还暂无报道。前期本实验室基于DNA条形码技术对4种龙胆科“地格达”类蒙药基原植物开展了鉴别研究工作，所得到的psbA-trnH序列为本研究提供了一定基础[12]。本实验通过采用位点特异性PCR方法对8种蒙医常用的蒙成药中肋柱花和苦地丁2种地格达类原料药材进行鉴别研究，为这类蒙成药的分子鉴别提供依据。

　　1 材料与方法 

　　1.1 材料 肋柱花基原植物5株、苦地丁基原植物3株分别采自内蒙古锡林郭勒盟和呼伦贝尔盟；苦地丁药材5批以及8种蒙成药均购自市场、医院或药店。其中《卫生部药品标准（蒙药分册）》中规定8种蒙成药均含有肋柱花、苦地丁或地丁原料药材，然而其中3种成药商品购买时外包装上未标记原料药材。凭证标本保存于包头医学院，实验材料采集及鉴定信息见表1，2。 

　　1.2 试剂 2×CTAB提取液，1×TAE缓冲液，琼脂糖（Promega公司）；溴化乙锭（Fluka公司）；DNA Taq聚合酶（Takara公司）；2 000 bp DNA Marker（Takara公司）；DNA纯化试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；牛血清白蛋白BSA S100（江晨生物）；聚乙烯吡咯烷酮 PVP40（江晨生物）；三氯甲烷，无水乙醇，异丙醇均为国产分析纯。 

　　1.3 仪器 PCR仪（ABI公司， 型号9700）；电泳系统（北京市六一仪器厂，型号DYY-12）；低温冷冻离心机（德国Eppendorf， 型号5810R）；VORTEX-2 GENIE漩涡震荡仪（Scientific industries 公司）；紫外凝胶成像分析仪（英国Syngene， 型号GBOXHR）；混合型球磨仪（德国Retsch，型号MM400）；微量移液器（德国Eppendorf）。 

　　1.4 特异鉴别引物的设计 选择通用引物psbA-trnH对肋柱花和苦地丁样品进行扩增，测序，去除引物序列，然后使用BioEdit分析软件进行分析、校对处理。同时从GenBank中下载8种蒙成药中含有的除动物药和矿物药外其他原料药材的psbA-trnH序列，见表3。为了评价参考序列的质量和准确性，对于来自不同学者提交的相同物种的参照序列进行ClustalW分析，比对结果表明，不同人提交相同物种的序列相似度为90%以上。在此基础上，对于每个物种从中挑选一条可信序列作为参照序列与测得的肋柱花和苦地丁psbA-trnH序列进行ClustalW比对分析，找出肋柱花和苦地丁的稳定差异变异位点，进而筛选出肋柱花和苦地丁的特有变异位点，根据其变异位点利用Primer premier 5 软件设计2对位点特异鉴别PCR引物（LR-F/R， CB-F/R），设计的2对特异引物扩增后片段大小分别为232，201 bp，引物序列见表4。 

　　1.5 总DNA提取及PCR扩增 DNA提取：8种蒙成药以及原料药材或基原植物取适量的样品，研磨破碎装入2.0 mL微量离心管中，采用改良CTAB法提取原料药材的总DNA。 

　　DNA纯化：分别将提取后的蒙成药总DNA使用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化后的DNA置于-20 ℃备用。 

　　PCR扩增：原料药材或基原植物反应体系总体积为20 μL，包括10×buffer缓冲液2 μL，dNTP 1.6 μL，引物各0.5 μL（psbA/trnH），EX Taq 0.2 μL，DNA 0.5 μL，灭菌蒸馏水14.7 μL。8种蒙成药扩增体系总体积仍为20 μL，其中减少灭菌蒸馏水的体积，加入BSA 0.5 μL，PVP 1 μL。引物使用通用引物rbcL（1F/724R）。各对引物PCR反应条件见表4。反应结束后在PCR体系中加入5 μL 6×loading buffer，混匀后于EB染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。 

　　1.6 位点特异性PCR鉴别8种蒙成药中地格达类原料药材 取8种蒙成药样品DNA进行位点特异PCR反应，反应体系为10×buffer缓冲液2 μL， dNTP 1.6 μL，引物各0.5 μL（5 pmol·L-1）， EXTaq酶0.2 μL （5 U·μL-1），DNA 0.5 μL，灭菌蒸馏水14.7 μL。PCR反应程序见表4。反应结束后在PCR体系中加入5 μL 6×loading buffer，混匀后于EB染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。 

　　2 结果 

　　2.1 8种蒙成药DNA 提取与PCR成功率 电泳检测结果表明8种蒙成药DNA条带较弱，暗示该DNA的浓度较低。但利用该DNA进行通用引物rbcL（1F/724R）PCR反应，5种蒙成药的PCR扩增产物经电泳后均可显示出较亮条带，而另外3种蒙成药PCR扩增产物经电泳后均显示较弱的条带，见图1。结果显示，采用的改良CTAB法提取8种蒙成药的总DNA可成功用于成药的分子鉴别。 

　　2.2 蒙成药中肋柱花原料特异性鉴别 将8种蒙成药DNA作为模板，利用肋柱花特异引物LR-F/R进行PCR扩增，反应结束后在PCR体系中加入5 μL 6×loading buffer，混匀后于EB染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。检测结果表明， 3种中成药（MPM01，MPM02，MPM03）在以上PCR反应条件下均可以稳定的扩增出232 bp条带，而其他蒙成药都未检测到特异条带，见图2，表5。 扩增后的PCR产物进一步测序，所得序列去除引物序列后，并在GenBank数据库中进行BlastN分析，与报道的肋柱花序列（GenBank number： HM460865）相比，所测序列的Maximum identity均为100%， E-value等于1e-92。结果表明MPM01 和MPM03 与卫生部药品标准（蒙药分册）中描述相一致，而MPM05在标准中描述有肋柱花，却没有检测到；相反，MPM02被描述原料中本不应该存在肋柱花，本实验却检测到肋柱花存在[2-3]。 

　　2.3 蒙成药中苦地丁原料特异性鉴别 将8种蒙成药DNA作为模板，利用苦地丁特异引物CB-F/R进行PCR扩增，反应结束后在PCR体系中加入5 μL 6×loading buffer，混匀后于EB染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。检测结果表明， 3种中成药（MPM04，MPM07，MPM08）在以上PCR反应条件下均可以稳定的扩增出201 bp条带，而其他蒙成药都未检测到特异条带，见图3，表5。 扩增后的PCR产物进一步测序，所得序列去除引物序列后，与本实验中测得的苦地丁序列相比，所测序列的Maximum identity均为99%以上。本实验结果表明MPM04 and MPM07与卫生部药品标准（蒙药分册）中描述相一致，MPM02和MPM06在标准中描述有苦地丁却没有检测到，说明在MPM02 和MPM06中可能不存在苦地丁原料药材。相反，MPM08被描述原料中本不应该含有苦地丁药材，标准中规定原料为地丁，却检测到苦地丁存在。