摘要：基于前期研究中获得的１４个苹果茎痘病毒（ＡＳＰＶ）分离物，将其分别接种于不同草本、木本指示植物，分析其在不同寄主上的症状变化特点。结果显示，ＡＳＰＶ各分离物只局部侵染草本指示植物西方烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ），而均未引起系统侵染；不同分离物接种的西方烟各植株症状没有明显差别。在木本指示植物中，所有分离物皆侵染杂种榅桲（Ｐｙｒｏｎｉａ ｖｅｉｔｃｈｉｉ）和Ｓｐｙ２２７，部分分离物不侵染光辉（R65-76 Radiant），仅少数病毒分离物在梨品种考密斯（Ｄｏｙｅｎｎｅ ｄｕ Ｃｏｍｉｃｅ）上显示症状。总体来看，杂种榅桲最适合做ＡＳＰＶ的指示植物，其次为Ｓｐｙ２２７，最后是光辉。不同分离物在不同指示植物上的症状较复杂，并未呈现明显规律性，因而单纯以生物学症状特点难以进行系统的ＡＳＰＶ株系分化分析。

　　关键词：苹果茎痘病毒（ＡＳＰＶ）；检测；指示植物

　　中图分类号：Ｓ６６１．１；Ｓ４３６．６１１．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０14）09－2055-03

　　Biological Identification of ASPV

　　ＬI Ｌｉ-ｌｉ

　　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Harbin 150081,China）

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：14 Chinese isolates of ASPV obtained from previous study were inoculated in various woody and herbaceous indicators. The system variation and characteristic of different hosts were analyzed. The results showed that ASPV isolates only partially infected Nicotiana occidentalis and the systems were the same on the whole. In woody indicators, Pyronia veitchii and Spy227 could be infected by all isolates, but R65-76 Radiant could be infected by partial isolates. The systems of few isolates could be found in Doyenne du Comice. On the whole, Pyronia veitchii was the best indicator plant for ASPV, and Spy227 was the second best indicator plant for ASPV. R65-76 Radiant was worse than Pyronia veitchii and Spy227. The systems of various ASPV isolates were complicated in different indicator plants. No obvious rule could be found, therefore, the strain differentiation could not be systematically analyzed only by the biological characteristic.

　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Apple stem pitting virus(ASPV); detection; indicator plants

　　苹果茎痘病毒（ＡＳＰＶ）是一种严重危害果树生产的潜隐性病毒。ＡＳＰＶ主要侵染苹果和梨，ＡＳＰＶ常与苹果退绿叶斑病毒（ＡＣＬＳＶ）、苹果茎沟病毒（ＡＳＧＶ）等混合侵染，导致苹果和梨产量降低，品质变劣［１］。

　　ＡＳＰＶ在中国危害较严重，植株带毒率普遍较高。刘福昌等［２］报道我国的渤海湾、黄河故道和西北高原苹果主产区主栽苹果品种和营养系矮生砧木普遍受ＡＳＰＶ、ＡＳＧＶ、ＡＣＬＳＶ侵染，其中ＡＳＰＶ带毒率普遍高于５０％，金冠、元帅的带毒率则高于８０％。王国平等［３］研究结果表明我国北方梨产区主栽品种上ＡＳＰＶ的平均带毒率为６１．８％。

　　生物学方法长期以来一直是进行病毒鉴定及株系划分最基础的方法之一，主要通过病毒汁液摩擦接种、二重芽接法等方式接种于寄主植物上，根据寄主症状表现及寄主范围来对病毒或病毒株系进行鉴定［４］。该方法的结果较直观，适合基层农技人员使用，此外，也利于发现新的病毒株系。基于前期研究中获得的１８个ＡＳＰＶ分离物，本研究将其分别接种于不同草本、木本寄主植物，分析其在不同寄主上的症状变化特点，并进一步探索基于生物学方法对ＡＳＰＶ进行株系分化研究。

　　１材料和方法

　　１．１植物材料

　　采集苹果样本，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术和ＥＬＩＳＡ技术检测ＡＣＬＳＶ、ＡＳＧＶ和ＡＳＰＶ的侵染情况［５］，确定仅受ＡＳＰＶ侵染的样本进行后续研究，共获得了１４个ＡＳＰＶ分离物，分别命名为ｐｖ２、ｐｖ４、ｐｖ５、ｐｖ６、ｐｖ７、ｐｖ９、ｐｖ１０、ｐｖ１１、ｐｖ１３、ｊｆ１、ｊｆ２、ｊｆ３、ｊｆ４、ｊｆ５。

　　草本指示植物为西方烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ） ３７Ｂ；木本指示植物包括Ｓｐｙ２２７、光辉（Ｒ６５－７６ Ｒａｄｉａｎｔ）和杂种榅桲（Ｐｙｒｏｎｉａ ｖｅｉｔｃｈｉｉ），梨品种考密斯（Ｄｏｙｅｎｎｅ ｄｕ Ｃｏｍｉｃｅ）。

　　１．２病毒汁液摩擦接种

　　温室播种西方烟，待西方烟长到３～４叶时进行接种。研钵放于１８０ ℃烘箱灭菌，然后将研钵和接种缓冲液置冰上预冷；向西方烟叶片撒上金刚砂（１ ０００目），取出待检样品叶片，加入２～５倍（Ｗ／Ｖ）接种缓冲液和少许金刚砂，低温条件下迅速研磨，用研磨棒蘸取汁液，轻轻涂抹叶面，蒸馏水冲洗接种叶面，每个样品分别用两种缓冲液重复４次，放置温室观察。

　　１．３二重芽接法

　　播种砧木山定子和杜梨，第二年定植实生苗，之后进行二重芽接，接种受ＡＳＰＶ感染接穗（ＲＴ－ＰＣＲ检测显示未受ＡＳＧＶ和ＡＣＬＳＶ感染）［５］。当指示植物如苹果时用山定子作砧木，为梨时则用杜梨作砧木。先将供试毒源样品的芽片嫁接在实生砧的基部，然后再把指示植物的芽片嫁接在毒源芽片接口上方约２ ｃｍ处。每样品／指示植物组合重复４次。第二年苗木发芽前，在指示植物接芽的上方约１０ ｃｍ处剪除砧干。苗木发芽后摘除毒源芽的生长点，以促进指示植物嫁接芽的生长。定期观察指示植物的症状反应。

　　２结果与分析

　　２．１不同ＡＳＰＶ分离物摩擦接种草本指示植物后的症状分析

　　将不同ＡＳＰＶ分离物摩擦接种草本指示植物西方烟３７Ｂ约７ ｄ后，接种叶片上出现白色坏死斑点、退绿斑、叶片皱缩畸形或小凸起等明显症状，而健康叶片未见明显症状（图１）。不同分离物接种的西方烟３７Ｂ各植株症状没有明显差别。同时在后期的观察中，系统叶片没有表现任何病症，由此可以判断ＡＳＰＶ各分离物只局部侵染西方烟３７Ｂ，而均未引起系统侵染。接种ＡＳＰＶ不同分离物的西方烟３７Ｂ各植株叶片均表现出了畸形、皱缩和坏死斑的相同症状，仅有ｊｆ３、ｐｖ１０、ｐｖ１１和ｐｖ１３四个分离物侵染的植株叶片额外有小凸起的症状。

　　２．２不同ＡＳＰＶ分离物二重芽接法木本指示植物后的症状分析

　　木本指示植物观察结果显示，杂种榅桲在初期表现不同程度的叶片反卷症状，有的分离物还有叶片黄斑、舟形叶症状，如分离物ｐｖ１３、ｊｆ５；至６月上旬植株矮化，８月初主干皮层表现坏死斑，后期剥开树皮，有的可见木质部的茎痘斑；光辉经ＡＳＰＶ侵染后主要表现叶片反卷、植株矮化，部分植株还会出现叶片皱缩、木质部茎痘斑的现象；５月下旬至６月上旬Ｓｐｙ２２７出现叶片反卷的症状，６月中旬以后主干皮层表面产生不规则的红褐斑，有些植株顶端枯死，生长衰退或矮化，木质部表面有凹陷斑（图２）。