Nrf2—ARE通路在帕金森病大鼠黑质中的表达改变(2)

　　1.2 实验动物脑内纹状体中氧化应激参数丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）含量测定

　　最后1次药物注射结束后24 h，大鼠直接断头取脑，在冰盘上迅速分离纹状体，4℃生理盐水冲洗血液，液氮速冻，于-80℃低温冰箱保存用于测量氧化应激参数（MDA和GSH）。具体实验方法按所购试剂盒说明书进行。

　　1.3 Western blott检测两组大鼠中脑黑质中Nrf2、HO-1和NQO1的表达

　　最后1次药物注射结束后24 h，大鼠直接断头取脑，在冰盘上迅速分离黑质所在脑块，4℃生理盐水冲洗血液，入液氮速冻后置-80℃低温冰箱保存备用。取所需脑组织入4℃裂解液匀浆5 min，冰浴静置1 h，4℃ 2000 r/min离心5 min，取上清，Bradford法测定蛋白浓度。相关样品取50 μg总蛋白经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，依照实验目的分别加入5%脱脂奶粉稀释的兔Nrf2、HO-1和NQO1单克隆抗体（1∶1000），4℃过夜。PVDF膜以TTBS洗3次。山羊抗兔IgG 荧光抗体（1∶10000，Rocland公司）室温避光1 h，漂洗5次，远红外荧光扫描成像系统（Odyssey公司）扫描并测定目标蛋白单位光密度值，与β-actin（1∶5000，Santa Cruz）比值后，做统计学分析。

　　1.4 统计学方法

　　采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 一般状况

　　与对照组相比，实验组大鼠毛色变黄、变脏，体态呈弓背状，行为上表现为主动活动减少、动作迟缓、步态不稳、行走时多向一侧旋转。两组在第10、13、15、19 d时各死亡1只大鼠。

　　2.2 实验大鼠纹状体中氧化应激参数的改变

　　实验组脑内纹状体中MDA含量与对照组比较，实验组大鼠纹状体中MDA升高了64.09%（P < 0.01）。实验组纹脑内状体中GSH含量与对照组比较，实验组大鼠纹状体中GSH降低了40.69%，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

　　2.3 Nrf2、HO-1和NQO1在实验大鼠黑质中的表达

　　与对照组比较，实验组大鼠黑质神经元中Nrf2、HO-1和NQO1表达分别降低了48.15%、41.67%和63.74%，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2、图1。

　　3 讨论

　　PD是中老年人群中比较常见的神经系统变性疾病，其主要的病理改变是中脑黑质内多巴胺能神经元渐进性受损，导致脑内多巴胺神经递质含量减少，从而出现一系列以运动障碍为主要表现的临床综合征。基础医学和生命科学领域近年的研究结果表明，许多慢性疾病都与人体内累积过多的自由基有关，PD与自由基及氧化应激之间的关系日益成为人们研究的热点。目前大量的研究证实氧化应激产生的氧自由基损伤为PD发病的重要病理机制[3-4]。机体生理状态下，体内自由基的产生和清除处于平衡状态，当这种平衡被打破，自由基蓄积过多，就会导致氧化损伤，即所谓氧化应激。氧化损伤使脂质、蛋白质和DNA过氧化，最终导致细胞死亡[5-6]。众所周知，中枢神经系统含有丰富的脂质成分，耗氧量最高且抗氧化酶相对缺乏，所以对自由基损伤特别敏感[7]。综上所述，本研究组有理由认为抗氧化、清除氧自由基的治疗方法能为PD的药物治疗提供新的靶点。

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