Smurf2在小管上皮细胞转分化中的表达及MG—132对其的影响(2)

　　TGF-?1（5ng/ml）作用于HK2细胞后迅速诱发Smad2/3磷酸化，10min表达上调80倍（与0min比较，P<0.01），1h为对照组的150倍（P<0.01），12h为对照组近170倍，随后逐渐下降，24h时仍高于0min时（P<0.01）。以10min作为时间点，观察4组P-Smad2/3蛋白表达。结果显示：对照组及MG-132组无Smad2/3磷酸化表达，TGF-?1组Smad2/3磷酸化表达上调80倍（与对照组比较，P<0.01）,TGF-?1+MG-132组，Smad2/3磷酸化表达较TGF-?1组下降80%(P<0.01),但Smad2/3磷酸化并未被完全阻断。

　　2.6免疫荧光（×200）检测间充质细胞标记物的表达

　　对照组及MG-132组中，免疫荧光检测可见细胞E-cadherin和cytokeratin表达；无α-SMA表达；TGF-?1刺激24h后，可见细胞E-cadherin和cytokeratin表达减少；细胞重新合成α-SMA；TGF-?1+MG-132组可见E-cadherin和cytokeratin表达增加，同时基本未见重新表达的α-SMA

　　3讨论

　　Smads蛋白是TGF-β1/-Smads信号途径中关键的细胞信号内介质，在该信号传导过程中，活化的R-Smads(Smad2/3)和抑制因子如Smad核转录共抑因子SnoN的表达被精密调节并保持平衡，确保TGF-β信号输出的稳定性，从而维持正常的生理功能[1-2]。除了基因转录水平的调节外，Smads信号蛋白的表达可被泛素蛋白酶体途径（UPP）降解。UPP主要由四部分组成：泛素、泛素连接酶、26S蛋白酶体系统和泛素再循环酶。Smurf2是由748个氨基酸组成的多肽，属于泛素连接酶HECT结构域E3S家族的成员之一[2,4-5,8]。它是由Lin等[9]通过酵母双杂交技术分离鉴定出的具有与Smad2相互作用的泛素化调节因子。因其特异性识别靶蛋白底物、催化其泛素化，因而在UPP介导的蛋白降解中起到了决定性的作用。

　　本研究中我们观察到,TGF-?1作用于肾小管上皮细胞后Smurf2mRNA和蛋白的表达均迅速上调,与此同时SnoNmRNA表达亦相应上调。但有趣的是，Smurf2表达上调的同时也伴有SnoN蛋白表达的显著下调。在应用UPP阻断剂MG-132阻断UPP系统后，Smurf2mRNA和蛋白水平明显下调，其表达水平接近对照组表达水平；与此同时SnoN蛋白表达却明显上调接近对照组表达水平，而MG-132对SnoNmRNA的表达无明显影响。Fukasawa[6]等的研究证实：在梗阻性肾病中，Smurf2表达增加，并与SnoN形成复合物，导致SnoN蛋白的泛素化和降解显著增加，并且Smurf2的免疫耗竭可导致SnoN泛素化的减少。因此我们推测，本研究中TGF-?1诱导人近端小管上皮细胞SnoN蛋白的下调主要是由于Smurf2介导SnoN蛋白遭遇UPP降解增加所致，而不是由于基因转录水平的减弱。实验中同时观察到随着Smurf2表达增高，细胞E-cadherin和cytokeratin表达减少，同时重新表达α-SMA，而且Smurf2出现表达增高的时间明显早于α-SMA的表达。在应用MG-132阻断UPP系统，Smurf2表达降低的同时,免疫荧光检测的结果提示TGF-?1介导的α-SMA的表达亦被拮抗，同时E-cadherin和cytokeratin表达增加，这说明Smurf2在TGF-?1导致小管上皮细胞转分化过程中起重要作用，而且Smurf2表达增高很可能是TGF-?1/Smads通路活化的必要条件。

　　此外研究中我们还发现,TGF-?1可迅速诱导HK2细胞内Smad2/3磷酸化，酵母双杂交实验证明Smurf2可与活化的Smad2/3结合，并能优先与核内磷酸化Smad2/3结合促使其发生泛素依赖性降解[9]。但本研究中我们观察到TGF-?1诱导人近端小管上皮细胞Smad2/3磷酸化的表达增高与Smurf2表达增高是一致的。而且研究中我们还观察到应用UPP阻断剂MG-132阻断了Smurf2表达增高，抑制小管上皮细胞转分化发生时，并不能完全阻断Smad2/3的磷酸化，Tan等[7]观察到在纤维性肾病模型中Smurf2与Smad3类似表达，但是通过转染使过度表达Smurf2可使Smad2/3的泛素化增加进而Smad2/3表达降低，可能的解释是TGF-β1致小管上皮细胞转分化过程中Smad核转录共抑因子SnoN的丢失比Smad2/3的丢失更重要，Smurf2可能是在细胞水平通过下调SnoN蛋白的表达从而对TGF-β1/Smad信号转导起重要影响。因此提示我们尽管Smurf2可同时介导TGF-β1/Smads信号中阳性调节因子SnoN和阴性调节因子Smad2/3的表达，但在TGF-β1介导小管上皮细胞转分化过程中，Smurf2功能的失调并且最终作用是增强TGF-β1/Smad信号活性，可能是导致小管上皮细胞转分化进而纤维化的主要原因。由于Smurf2在小管上皮细胞转分化过程中功能的复杂性，因此，单纯阻止Smurf2的表达可能并不是最佳的延缓肾脏纤维化的治疗措施。

　　MG-132是一种人工合成的有效，可逆的醛基肽类蛋白酶体抑制剂，能阻止26S蛋白酶体对泛素结合酶的降解，抑制20S蛋白酶体的糜凝乳蛋白酶活性，从而阻断泛素蛋白酶体通路。Meiners等[10]给自发性高血压大鼠腹腔内注射小剂量MG-132，可下调心肌成纤维细胞MMPs,使胶原纤维沉积显著减少。有研究发现肿瘤坏死因子参与调节梗阻性肾病时小管间质细胞的增殖和凋亡,而MG-132能够抑制其受体相关死亡结构域的降解[11]。也有学者认为在肾脏急性缺血再灌注时,蛋白酶体抑制剂虽然能够抑制炎症细胞和炎症因子的侵入,但是同时也加速肾小管上皮细胞的凋亡而加剧缺血再灌注损伤[12]。因此适时有效地使用蛋白酶体阻断剂是治疗的关键。本研究观察到2.5uM的MG-132可抑制TGF-β1诱导的Smurf2mRNA和蛋白的表达，恢复SnoN蛋白的表达，逆转小管上皮细胞转分化，可能为日后进一步防治肾小管间质纤维化提供新的治疗方法。

　　参考文献

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　　2、BranGM,SommerUJ,GoesslerUR,etal.TGF-β1antisenseimpactstheSmadsignallingsysteminfibroblastsfromkeloidscans.AnticancerRes.2010-Sep;

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　　3、李颖,何威等.脂溢性角化病皮损区smurf1和smurf2表达增强.第3军医大学学报，2007,29(10):911-914

　　4、RunyanCE,HayashidaT,HubchakSetal.RoleofSARA(Smadanchorforrecaptoractiveation)inmaintenanceofepithetlialcellphenoltype.JBiolChem.2009Sep11:284(37):25181-9

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　　9、LinX,LiangM,FengXH.Smurf2isaubiquitinE3ligasemediating

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　　10、MeinerS,HocherB,WellerA,etal.Downregulationofmatrixmetalloproteinasesandcollagensandsuppressionofcardiacfibrosisbyinhibitionoftheproteasome.Hypertension,2004,44(4):471-47

　　11、MisakiT,YamamotoT,SuzukiS.Decreaseintumornecrosisfactor-alphareceptor-associateddeathdomainresultsfromubiquitin-dependentdegradationinobstructiverenalinjuryinrats.AmJPathol,2009,175(1):74-83.

　　12、HuberJM,TagwerkerA,HeiningerD,etal.TheproteasomeinhibitorBortezomibaggravatesrenalischemiareperfusioninjury.AmJPhysiolRenalPhysiol,2009,297(2):F451-F460.

　　13、贾宁，王汉，林琳，等.泛素系统在人近端小管上皮细胞Smad信号传导通路中的作用[J].武汉大学学报（医学版），2007-05-15

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