摘要：为了探明罗田板栗新品系玫瑰红耐贮藏的内在原因，评价其栗实中的内生细菌资源，用组织分离培养法从栗实中分离其内生细菌，并通过比对结构、生理生化特征及16S rDNA序列分析等方法对所分离的内生细菌进行鉴定。结果从玫瑰红板栗栗实中分离得到2株内生细菌FR1和FR2，经鉴定为水生拉恩菌和地衣芽孢杆菌。

　　关键词：罗田板栗；玫瑰红；内生细菌；分离鉴定；16S rDNA

　　中图分类号：S664.2；Q948.122.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）04-0806-03

　　板栗俗称栗子，营养丰富，风味较佳，是重要的干果品种，中国板栗的栽培面积和总产量均居世界首位。板栗对山区经济发展和出口创汇具有重要意义。但由于其含水量高的特点，贮藏期易发生栗实腐烂，腐烂率甚至可高达50%，严重制约了板栗产业的发展[1]。栗实腐烂的发生机理及绿色防治逐渐成为研究热点[2-5]。

　　内生菌是指在生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部，且被感染的宿主植物（至少是暂时）不表现出外在病症的真菌或细菌[6]。这些内生菌对宿主植物的生长发育、抗逆性、抗虫性及抗病性方面均有重要作用，在农业生产、化工制药、卫生保健等方面有巨大的潜力[6，7]。研究者已在棉花、玉米、甜菜、烟草和黄瓜等多种作物体内分离筛选到具有防病或诱导抗病的内生真菌和细菌[6-10]，但关于板栗栗实内生细菌资源的研究鲜见报道。试验以新培育的耐贮藏南方板栗——罗田板栗新品系玫瑰红栗实为研究对象，采用组织分离法分离，并利用16S rDNA序列分析和形态、生理生化相结合的方法鉴定其内生细菌，以期为筛选抗栗实腐烂的拮抗细菌及开发生防保鲜剂奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 板栗果实 板栗品系为玫瑰红，采摘于湖北省罗田县胜利镇，去苞壳后得到栗实。

　　1.1.2 培养基 LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH 7.2。

　　1.1.3 主要试剂 克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司；2×Taq mix、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000购自宝生物工程（大连）有限公司，大肠杆菌TOP10菌株为经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室保存；细菌16S rDNA通用引物27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′由上海生工生物工程有限公司合成。其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 栗实处理 将栗实在自来水下流水冲洗后，用75%的乙醇浸泡3 min，再用8%次氯酸钠浸泡10 min，无菌水清洗5～7次，用无菌吸水纸吸干水分。取清洗最后一遍的无菌水0.2 mL涂布于LB培养基上，37 ℃培养3 d，据此验证所用消毒方法是否能杀死供试材料表面全部细菌[11]。

　　1.2.2 内生细菌分离纯化 在无菌环境中，用无菌小刀将处理好的栗实切开并去壳，在种仁中心区和边缘区处切取边长为2～5 mm的正方体组织块，置于经消毒灭菌的研钵中，加无菌水适量，研磨，静置15 min，取研磨后的上清液稀释成500倍和1 000倍的组织稀释液，取200 μL涂布于LB培养基上，于37 ℃倒置恒温培养1～2 d，从LB平板上将具有不同菌落形态特征的内生细菌单菌落挑出，划线纯化培养，获得的细菌单株进行编号、转管，4 ℃冰箱保存。

　　1.2.3 内生细菌初步鉴定 将分离的内生细菌适当稀释后接种到LB培养基上，置于36 ℃的温箱内培养1～2 d，观察菌株形态和培养性状，进行革兰氏染色和生理生化试验，对照文献[12]和文献[13]进行初步鉴定。

　　1.2.4 内生细菌分子学鉴定 将分离纯化的板栗内生细菌进行活化，挑取少量菌体以细菌16S rDNA通用引物27F、1 492R进行菌落PCR扩增，PCR扩增反应体系50 μL，18 μL无菌ddH2O，25 μL 2×Taq mix，1.5 μL Primer1，1.5 μL Primer2，4 μL悬浮菌液；PCR流程：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，35次循环；延伸补齐72 ℃ 10 min。扩增产物经过纯化后连接到克隆载体pMD18-T上，转化感受态大肠杆菌TOP10（CaCl2法制备感受态细胞），然后将转化的大肠杆菌TOP10涂布在加有100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂固体培养基上，37 ℃恒温培养12～18 h；从上述LB平板上随机挑取5个白色菌落，转移到含有氨苄青霉素的LB培养基上，37 ℃过夜，将通过PCR重组子验证的菌落送交上海生工生物工程有限公司双向测序，测序结果进行BLAST比对，选取同源性高的16S rDNA序列作为参比对象，使用ClustalX进行DNA序列的排序，采用MEGA 5.1软件中的邻接法构建系统发育树，并进行1 000次的自展检验，将ME树上与之最接近的种类确定为内生菌可能的种类。