一种高质量天门冬基因组DNA提取方法(2)

　　2 结果与分析

　　2.1 天门冬DNA纯度及产率

　　经紫外分光光度计检测，天门冬DNA样品的OD260 nm/OD280 nm=1.86（0.078/0.042），OD260 nm/OD230 nm=2.36（0.078/0.033），说明改良CTAB法提取的天门冬DNA纯度较高，没有多糖、多酚、蛋白质、RNA、盐和小分子杂质污染。计算得到DNA质量浓度为390 μg/mL，DNA产率为11.7 μg/g。

　　2.2 天门冬DNA分子完整性

　　将天门冬DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现，改良CTAB法提取的天门冬DNA电泳条带明亮、清晰，无拖尾、弥散现象，说明该方法提取的天门冬DNA分子完整性较好，无降解现象。图1为天门冬总DNA电泳图。

　　2.3 天门冬DNA SCoT-PCR扩增结果

　　用改良后的CTAB法提取的天门冬DNA作为模板进行SCoT-PCR扩增。取PCR扩增产物10 μL进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，所得SCoT-PCR扩增条带清晰，带型丰富，无杂带，可以用于天门冬种质资源遗传多样性分析。

　　3 小结与讨论

　　高质量基因组DNA的提取是进行分子标记等分子生物学研究的基础[11]，天门冬成熟叶片富含多糖、多酚、蛋白质和次生代谢物质等，在DNA提取过程中，此类物质可与DNA共沉淀、形成胶状难溶物或产生褐变，严重影响DNA的质量[12，13]。而幼嫩新生组织中的多糖、多酚和次生代谢物质较少，细胞易于破碎，DNA提取产率高。因此，应选择幼嫩、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料[14]。

　　通过一系列措施，有效控制了天门冬成熟叶片中多糖、多酚、蛋白质和次生代谢物质等对DNA提取的影响。首先，CTAB既能有效裂解植物的细胞壁，又能溶解细胞膜，可较好地去除多糖等杂质；其次，高分子合成树脂PVP作为一种酚的络合物，同时含有亲水基团和亲油基团，易溶于极性的有机溶剂，可有效地去除酚类物质[15]；而β-巯基乙醇的巯基能与酚类物质竞争氧，从而避免其氧化成醌类[16]，但PVP和β-巯基乙醇单独使用效果不好，只有将二者按一定比例配合使用效果才理想。

　　改良CTAB法提取植物基因组DNA过程中，通过氯仿-异戊醇抽提，除去蛋白质等杂质，试验发现，抽提1次，尚有杂质残留，抽提3次，DNA产率降低，而抽提2次的DNA质量较高，这与陆嘉惠等[17]的报道基本一致。

　　植物基因组DNA提取方法较多，但其原理基本相同，主要包括破碎细胞、裂解细胞或组织，以去诟剂溶解细胞膜，从而促使蛋白质变性，再用氯仿-异戊醇等有机溶剂对DNA进行抽提纯化。由于核酸基本集中在细胞内，所以研磨的质量好坏是提取基因组DNA的关键，只有充分研磨，细胞才能破碎，核酸才得以释放[18]。

　　本试验是在CTAB法的基础上进行改良的，以传统的CTAB法为对照，但是由于成熟叶片富含多糖、多酚、蛋白质和其他次生代谢物质，传统的CTAB法无法提取天门冬的DNA，电泳结果为空白，故本试验只对改良CTAB法进行分析和PCR扩增验证。

　　参考文献：

　　[1] 中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2010.

　　[2] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第十五卷）[M].北京：科学出版社，1978.106-108.

　　[3] 王海萍，陈雪芬.中药材天门冬的鉴别及其临床应用[J].中药现代药物应用，2008，2（8）：39-40.

　　[4] 李志孝，黄成钢，蔡育军，等.天门冬多糖的化学结构及体外抗氧化活性[J].药学学报，2000，35（5）：358-362.

　　[5] 徐从立，陈海生，谭兴起，等.中药天冬的化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2005，17（2）：128-130.

　　[6] 熊大胜，许云香，郭春秋.天冬块根药用成分对小鼠抗氧化延缓衰老的影响[J].湖南文理学院学报，2009，21（4）：41-43.

　　[7] 韦树根，马小军，柯芳，等.天冬新品种药园天冬2号的选育与栽培技术[J].作物杂志，2011（4）：107-108.

　　[8] 吴华，单秀梅.天门冬人工栽培技术[J].中国林副特产，2012（4）：76-77.

　　[9] 曾桂萍，潘化仁.中药天冬叶片DNA的提取方法比较研究[J].贵州农业科学，2009，37（6）：18-20.

　　[10] 曾桂萍，潘化仁，刘红昌.正交优化设计天冬ISSR反应体系的研究[J].种子，2009，28（5）：49-51，55.

　　[11] SASSA H.A technique to isolate DNA from woody and herbaceous plants by using a silica-cased plasmid extraction column[J].Analytical Biochemistry，2007，363：166-167.

　　[12] NIKOLOUDAKIS N，BANILAS G，GAZIS F，et al.Discrimination and genetic diversity among cultivated olive of Greece using RAPD marker[J].J Amer Soc Hort Sci，2003，128（5）：741-746.

　　[13] WANG D H，SONG K M，KREADER C，et al.A high-throughput system for the rapid extraction of plant genomic DNA for genome mapping and marker-assisted breeding studies[J].Journal of Association for Laboratory Automation，2005，10（4）：242-245.

　　[14] POREBSKI S L，BAILEY G，BAUM R B.Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plant containing high polysaccharide and polyphenol compinents[J]. Plant Mol Rep，1997（12）：8-15.

　　[15] 罗志勇，周钢，陈湘晖，等.高质量植物基因组DNA的分离[J].湖南医科大学学报，2001，26（2）：178-180.

　　[16] 李莉，彭建营，白瑞霞.不同方法对枣叶总DNA提取效果的影响[J].果树学报，2007，24（3）：389-392.

　　[17] 陆嘉惠，李学禹，马淼，等.甘草属植物DNA提取方法研究[J].生物技术，2006，16（3）：45-47.

　　[18] 萨姆布鲁克J，拉塞尔D W.分子克隆实验指南（第3版）[M].黄培堂译.北京：科学出版社，2002，463-469.

　　论文榜（www.zglwb.com），是一个专门从事期刊推广、投稿辅导的网站。
本站提供如何投稿辅导，寻求投稿辅导代理，快速投稿辅导，投稿辅导格式指导等解决方案：省级投稿辅导/国家级投稿辅导/核心期刊投稿辅导//职称投稿辅导。


期刊鉴别	论文检测	免费论文	特惠期刊	学术答疑	发表流程

搜索

一种高质量天门冬基因组DNA提取方法(2)